谱析浅谈高效液相色谱仪反相柱的清洁和再生

    反相色谱是迄今在高效液相色谱仪中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的固定相都是天然的疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小来分离的，含有疏水的机制也能以同样的保留方式分离.

       什么导致反相柱子污染产生？通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的东西。盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能在使用时与HPLC柱发生相互作用的物质。这些物质有比分析者的目标物或少或大的保留值。那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线上移或者是负峰。如果样品成分在柱子中有很强的保留而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。这些行为通常只有通过平行实验才能发现。有着中等保留值的样品能被缓慢洗出而且表现为宽峰，基线扰动，或者基线漂移。

       有时候这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相。分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理。保留时间会波动，拖尾会出现。如果足够的污染产生，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，使柱子无法工作以及在堵塞处产生空体积，再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往能恢复其色谱行为。有时候，经过多次操作以后的色谱柱用90～100％的溶剂B（双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗20个体积可以清除污染物。例如，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢 呋喃。

    如果你使用的是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头 堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水）。冲洗5～10个体积以后才更换强溶剂。有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么更强的溶剂或者是一系列溶剂就有必要用来清洗柱子了，如果污染物是非生物物质，使用者可以跳过一个或多个另外的有机溶剂去除污染物。溶剂与溶剂之间的组合有很多。到柱子厂家的网页上能找到推荐的溶剂系统。

       一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性物质 如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。

        清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如， 异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。

        当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。成功再生反相柱子是一个非常耗时间的过程，溶剂冲洗可以利用梯度系统过夜操作。